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蛋白纯化

Heparin Sinorose 6 Fast Flow

Heparin是一种含硫酸酯的酸性多糖,将它偶联到活化的琼脂糖凝胶上,能够制备成Heparin亲和层析填料;该填料具有很高的物理化学稳定性。 肝素能和抗凝血因子Ⅲ、凝血因子、蛋白合成因子、脂蛋白、干扰素、核酸结合蛋白、限制内切酶、凝血酶及类凝血酶等生物大分子结合,所以肝素琼脂糖凝胶可以用于这类物质的纯化,且皆可应用于上述产品的分离纯化,同时产品具有基团脱落少,物理及化学性质稳定、应用广泛、使用寿命长,操作方便等优点。...
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产品介绍

1     产品简介

Heparin是一种含硫酸酯的酸性多糖,将它偶联到活化的琼脂糖凝胶上,能够制备成Heparin亲和层析填料;该填料具有很高的物理化学稳定性。 肝素能和抗凝血因子Ⅲ、凝血因子、蛋白合成因子、脂蛋白、干扰素、核酸结合蛋白、限制内切酶、凝血酶及类凝血酶等生物大分子结合,所以肝素琼脂糖凝胶可以用于这类物质的纯化,且皆可应用于上述产品的分离纯化,同时产品具有基团脱落少,物理及化学性质稳定、应用广泛、使用寿命长,操作方便等优点。

SC-Heparin 6FF预装柱是将Heparin Sinorose 6 Fast Flow介质装填于层析空柱中的即用型亲和层析柱;省去了客户自行装填层析柱的麻烦和柱效不高的风险。该类型预装柱广泛用于实验室工艺开发、样品的少量制备,适合于类凝血酶等的生物分子的分离纯化。

 

2     介质技术参数

外观

白色浆状物,放置可分层

基架

高度交联的6%琼脂糖

颗粒大小 +

45-165μm

功能基团

Heparin

配基密度

~4mg  Heparin /ml介质

结合载量

>3mg抗凝血因子Ⅲ(ATⅢ)/mL基质

耐压

0.3MPa

化学稳定性

所有常用水溶性缓冲液中稳定:8M尿素,6M盐酸胍,70%乙醇,50mM醋酸钠(pH4),10%甘油,0.1M   NaOH(20℃,一周)

压力流速

250-400cm/h0.1Mpa   XK50/30 柱高 25cm

pH稳定性

4-10(工作)3-13(CIP,短期)

温度耐受性

使用温度4~30℃,不能冻结,可121℃高压灭菌30min(高压时加20mM   NaH 2 PO 4 pH7.5

推荐流速

60~300cm/h

+颗粒大小呈正态分布,在该范围内的颗粒占总数的 95%以上

 

3     预装柱技术参数

产品名称

预装柱体积/ml

内径×柱床mm×mm

耐压

建议流速ml/min

保存液++

SC-Heparin 6FF

1

7×25

0.3MPa

0.2-2.0

含有0.05M乙酸钠的20%乙醇

5

16×25

1.0-10.0

+建议流速是使用过程中的流速,CIP过程及用到有机溶剂时用最低流速或40cm/h线性流速

++20%乙醇需要脱气

 

4     使用方法

4.1        将预装柱接入层析系统

Ø  打开包装,取出层析柱。使用前检查层析柱是否完好,以及层析柱在运输过程中是否进气变干,若发生以上情况请联系公司销售;

Ø  启动层析系统,确保排净层析系统内的气泡,并设置层析系统报警压为 0.3MPa,然后调整并保持最低流速运行;

Ø  将预装层析柱接入层析系统。

4.2        层析柱预处理

Ø  5个柱体积蒸馏水冲洗掉柱子里的20%乙醇。

4.3        层析方法

4.3.1    缓冲液:

  结合缓冲液:20-50mM PB TrispH7.4-8.0,可以加入 0.15M NaCl 抑制非特异吸附

  洗脱缓冲液:20-50mM PB Tris1-2M NaClpH7.4-8.0NaCl 浓度需要根据目标蛋白结合力进行适当调整

4.3.2    流速:根据柱子的高度一般选用 60~300cm/h 的流速,柱高越大流速越慢。

4.3.3    样品及上样量:为防止样品堵塞柱子,在上样前样品需要用 0.45μm 的微孔滤膜

4.3.4    过滤,并将样品的 pH 和电导调整到与平衡缓冲液一致,根据样品中的杂质含量和 Heparin 6FF 的结合载量确定上样体积。

4.3.5    洗杂:用平衡缓冲液冲洗至少5个柱体积,直至紫外吸收值降到适当值彻底平衡。

4.3.6    洗脱:可以采用线性梯度或者步级梯度增加洗脱液中的洗脱强度,将不同结合强度的物质从层析柱中洗脱下来,收集不同的组分,检测目的物所在的位置。

4.3.7    再生:用含有高浓度的盐(如 2M NaCl)冲洗层析柱。

4.3.8    再平衡:用平衡缓冲液冲洗后就可以进行第二次上样,如此重复。

 

5     柱效检测

5.1        柱效测定可以采用丙酮作为指示剂或者NaCl作为指示剂,按照下表配制指示剂溶液和流动相。


丙酮法测柱效

NaCl法测柱效

样品

1.0%v/v)丙酮水溶液

2M NaCl(溶于水)

样品体积

1.0%柱体积

1.0%柱体积

流动相

0.4M NaCl水溶液

流速

30cm/h

30cm/h

检测器

UV 280 nm

电导率

5.2        计算柱效

根据UV或者电导率曲线计算理论塔板高度(HETP)、理论塔板数(N)和非对称因子(As),公式如下:

HETP=L/N                        

N=5.54(VR/Wh) 2

其中:VR=保留体积 Wh=半高峰宽 L=柱高 N=理论塔板数

VRWh的单位应一致;

As=b/a

其中:

a= 10%峰高处的第一个半峰宽

b= 10%峰高处的第二个半峰宽

5.3        结果评价

由以上公式计算出的 HETP 的数值若小于三倍介质平均颗粒大小且非对称因子在0.8~1.8 则判定为合格。对于不理想的柱效需要分析原因并重新装柱。

 

6     注意事项

Ø  层析柱为塑料制品,不要使其长时间置于过酸过碱环境中;

Ø  为了避免堵塞层析柱,所有样品和缓冲液需要用 0.45um 膜过滤;

Ø  为了得到良好的分离效果,避免缓冲液与层析柱有太大温差变化;

Ø  层析柱可以放在层析冷柜中使用,但是需要适当降低流速;

Ø  层析柱放置在无阳光直射的地方。

 

7     清洗与再生

定期的在位清洗能防止污染物的累积,保持稳定的工作状态。每次使用之后都应该

进行在位清洗来保证结果重复性。对于不同类型的杂质和污染物建议清洗条件如下:

Ø  离子键结合蛋白的去除:先用 3-5CV 2M NaCl 清洗,后用 3-5CV 纯水冲洗。

Ø  沉淀或变性蛋白蛋白的去除:先用 2CV 0.1M NaOH 清洗,浸泡 2h,后用 5-10CV纯水冲洗,也可用 6M 盐酸胍或 8M 尿素清洗。

Ø  疏水性结合的蛋白的去除:0.1-0.5%的非离子去污剂清洗,后用 3-5CV 纯水冲洗。注:在位清洗过程中流速可选择 30-60cm/h,建议采用反向清洗。

清洗后要立即使用,用平衡缓冲液冲洗 3-5CV 后使用,如短期内不使用则用 20%乙醇溶液冲洗 3-5CV 将其保存。

 

8     灭菌

可采用 70%乙醇处理 12h 以上达到灭菌的目的。

 

储存

保存在含有0.05M乙酸钠的20%乙醇溶液中,4-30℃。为了防止乙醇挥发以及微生物生长,使用后的层析柱建议 3 个月更换一次新鲜的保存液

 

10   订购信息

货号

产品名称

规格

SCB0E006A

SC-Heparin   6FF

1ml

SCB0E006B

SC-Heparin   6FF

5ml

SCB0E006C

Heparin   Sinorose 6 Fast Flow

5ml

Heparin Sinorose 6 Fast Flow为对应填料


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