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蛋白纯化

GST Sinorose 4 Fast Flow

GST Sinorose 4 Fast Flow(GST 4FF)是一种GST标签蛋白纯化的生物亲和层析分离介质,结构上是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,通过原子的间隔臂,用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成,专门用于特异性纯化谷胱甘肽 S 转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)及 GST 融合蛋白的分离纯化。由于GST对底物的亲和力更高,不同来源的谷胱甘肽 S-转移酶及其融合蛋白均可采用该介质通过一步纯化即可得到高纯度的目标蛋白,具有更高的物理化学特性,可以耐受更高的压力,在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化,更适于工业大规模蛋白的纯化。...
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产品介绍

1     产品简介

GST Sinorose 4 Fast FlowGST 4FF)是一种GST标签蛋白纯化的生物亲和层析分离介质,结构上是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,通过原子的间隔臂,用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成,专门用于特异性纯化谷胱甘肽 S 转移酶(Glutathione S-TransferaseGST)及 GST 融合蛋白的分离纯化。由于GST对底物的亲和力更高,不同来源的谷胱甘肽 S-转移酶及其融合蛋白均可采用该介质通过一步纯化即可得到高纯度的目标蛋白,具有更高的物理化学特性,可以耐受更高的压力,在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化,更适于工业大规模蛋白的纯化。

SC-GST 4FF预装柱是将GST Sinorose 4 Fast Flow介质装填于层析空柱中的即用型亲和层析柱;该层析柱省去了客户自行装填层析柱的麻烦和柱效不高的风险。该类型预装柱广泛用于实验室工艺开发、样品的少量制备,适合于 GST 标签蛋白等生物分子的分离纯化。

 

2     介质技术参数

外观

白色浆状物,放置可分层

基架

高度交联的4%琼脂糖

颗粒大小 +

50-160μm

功能基团

含有10个原子臂的谷胱甘肽

配基密度

120~320μmol谷胱甘肽/ml填料

结合载量

~10mg   GST/ml填料(40kDa

化学稳定性

所有常用水溶性缓冲液中稳定:1M醋酸,   70%乙醇,6M盐酸胍(室温1小时)

pH稳定性

3-12

温度耐受性

4~30℃,不能冻存

最大流速

450cm/hXK16/10H=5cm

推荐流速

上样流速:<100cm/h;平衡、清洗、洗脱流速:100~300cm/h

+颗粒大小呈正态分布,在该范围内的颗粒占总数的 95%以上

 

3     预装柱技术参数

产品名称

预装柱体积/ml

内径×柱床mm×mm

耐压

建议流速+ml/min

保存液++

SC-GST 4FF

1

7×25

0.3MPa

0.2-2.0

20%乙醇

5

16×25

1.0-10.0

+建议流速是使用过程中的流速,CIP过程及用到有机溶剂时用最低流速或40cm/h线性流速

++20%乙醇需要脱气

 

4     使用方法

4.1        将预装柱接入层析系统

Ø  打开包装,取出层析柱。使用前检查层析柱是否完好,以及层析柱在运输过程中是否进气变干,若发生以上情况请联系公司销售;

Ø  启动层析系统,确保排净层析系统内的气泡,并设置层析系统报警压为 0.3MPa,然后调整并保持最低流速运行;

Ø  将预装层析柱接入层析系统。

4.2        层析柱预处理

Ø  5个柱体积蒸馏水冲洗掉柱子里的20%乙醇。

4.3        层析方法

4.3.1    样品溶液:

Ø  对于复杂的蛋白混合样品,样品的体积不宜过大,上样体积越大,其结合能力越弱;但对于和介质配基专一性结合的样品则不需要过多考虑样品体积。

Ø  样品浓度不宜过大,高浓度(大于 30mg/ml)可能引起 pH 和离子强度的波动,从而造成蛋白活性的损失,一般用结合缓冲液来稀释样品。

Ø  样品的黏度需要适当,高黏度的样品会造成层析过程中的流速不规则。

Ø  为了避免堵塞层析柱会降低层析柱的分辨效率和使用寿命,因此样品溶液上样前需离心处理或用 0.45μm 的滤器进行过滤。

4.3.2    结合缓冲液:一般选用中性缓冲液,如 20mM PB0.15 M NaClpH 7.3

4.3.3    流速:上样流速选择<100cm/h,平衡、清洗、洗脱可以适当增大流速,但不要超过 300cm/h 的流速。柱高越大流速越慢。

4.3.4    样品及上样量:将样品的 pH 和电导调整到与平衡缓冲液一致,根据样品中的杂质含量、流速等确定上样体积。

4.3.5    洗杂:用平衡缓冲液冲洗至少5个柱体积,直至紫外吸收值降到适当值彻底平衡。

4.3.6    洗脱:常用还原性谷胱甘肽进行洗脱,如:50mM Tris10mM 还原性谷胱甘肽,pH8.0缓冲液中可以加入 1~10mM DTT ,可以增加目的物的纯度。

 

5     柱效检测

5.1        柱效测定可以采用丙酮作为指示剂或者NaCl作为指示剂,按照下表配制指示剂溶液和流动相。


丙酮法测柱效

NaCl法测柱效

样品

1.0%v/v)丙酮水溶液

2M NaCl(溶于水)

样品体积

1.0%柱体积

1.0%柱体积

流动相

0.4M NaCl水溶液

流速

30cm/h

30cm/h

检测器

UV 280 nm

电导率

5.2        计算柱效

根据UV或者电导率曲线计算理论塔板高度(HETP)、理论塔板数(N)和非对称因子(As),公式如下:             

HETP=L/N                            

N=5.54(VR/Wh) 2                      

其中:VR=保留体积                   Wh=半高峰宽                        L=柱高                               N=理论塔板数                           

VRWh的单位应一致;

As=b/a

其中:

a= 10%峰高处的第一个半峰宽

b= 10%峰高处的第二个半峰宽

5.3        结果评价

由以上公式计算出的 HETP 的数值若小于三倍介质平均颗粒大小且非对称因子在0.8~1.8 则判定为合格。对于不理想的柱效需要分析原因并重新装柱。

 

6     注意事项

Ø  层析柱为塑料制品,不要使其长时间置于过酸过碱环境中;

Ø  为了避免堵塞层析柱,所有样品和缓冲液需要用 0.45um 膜过滤;

Ø  为了得到良好的分离效果,避免缓冲液与层析柱有太大温差变化;

Ø  层析柱可以放在层析冷柜中使用,但是需要适当降低流速;

Ø  层析柱放置在无阳光直射的地方。

 

7     清洗与再生

7.1        再生:定期的在位清洗能防止污染物的累积,保持稳定的工作状态。每次使用之后都应该进行在位清洗来保证结果重复性。

Ø  2 倍柱体积高 pH 缓冲液(0.1M Tris-HCl0.5M NaClpH8.5)和低pH缓冲液(0.1M 醋酸钠,0.5M NaClpH4.5)交替洗涤三次;10 倍柱体积结合缓冲液平衡层析柱。

7.2        清洗:如果使用一段时间后,介质因表面沉积过多杂质导致蛋白质结合能力下降,需对介质进行清洗。

Ø  沉淀或变性物质清洗:用 2倍柱体积的 6M 盐酸胍清洗,然后用 5倍柱体积的平衡缓冲液清洗;

Ø  疏水缔合物质的清洗:用 2倍柱体积的 70%乙醇清洗,然后用 5倍柱体积的平衡缓冲液清洗

 

8     灭菌

可采用 70%乙醇处理 12h 以上达到灭菌的目的。

 

9     储存

需保存在 20%乙醇溶液中,4-30℃。为了防止乙醇挥发以及微生物生长,使用后的层析柱建议 3 个月更换一次新鲜的保存液。

 

10   订购信息

货号

产品名称

规格

SCB0E005A

SC-GST   4FF

1ml

SCB0E005B

SC-GST   4FF

5ml

SCB0E005C

GST Sinorose 4 Fast Flow

5ml

GST Sinorose 4 Fast Flow为对应填料


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