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蛋白纯化

Ni NTA Sinorose 6 Fast Flow

Ni NTA Sinorose 6 Fast Flow(Ni NTA FF)是用于纯化6His标签重组蛋白的一种纯化介质,它是由6%交联的琼脂糖通过化学方法偶联次氮基三乙酸(NTA)为配体而得。螯合镍离子后,形成稳定的八面体结构,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或螯合剂。His可与Ni2+螯合,从而使His标签蛋白结合在Ni NTA FF纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来,从而得到高纯度的目的蛋白。该纯化介质与His标签蛋白具有极高的亲和力,可达5-20 mg/ml。可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。与其它类型的Ni离子填料相比,Ni NTA FF具有更高的蛋白载量、动态载量更高、以用于大规模蛋白的纯化,且使用寿命更长。...
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产品介绍

1     产品简介

Ni NTA Sinorose 6 Fast FlowNi NTA FF)是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质,它是由6%交联的琼脂糖通过化学方法偶联次氮基三乙酸(NTA)为配体而得。螯合镍离子后,形成稳定的八面体结构,可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或螯合剂。His可与Ni2+螯合,从而使His标签蛋白结合在Ni NTA FF纯化介质上,未结合的蛋白被洗涤下去,结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来,从而得到高纯度的目的蛋白。该纯化介质与His标签蛋白具有极高的亲和力,可达5-20 mg/ml。可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。与其它类型的Ni离子填料相比,Ni NTA FF具有更高的蛋白载量、动态载量更高、以用于大规模蛋白的纯化,且使用寿命更长。

SC- Ni NTA FF预装柱是将 Ni NTA Sinorose 6FF 介质装填于层析空柱中的即用型亲和层析柱,该层析柱省去了客户自行装填层析柱的麻烦和柱效不高的风险,且预装柱广泛用于实验室工艺开发、样品的少量制备,带有 His 标签的重组蛋白等生物分子的分离纯化等方面。

 

2     介质技术参数

外观

蓝色浆状物,放置可分层

基架

高度交联的6%琼脂糖

颗粒大小 +

45-165μm

功能基团

Ni   2+

配基密度

12-18μmol/ml介质

动态结合载量 ++

~   40mg His标签蛋白/ml介质

化学稳定性++

40   1周:10mM HCl0.1M   NaOH8M尿素,6M 盐酸胍;40

12h1M   NaOH70%乙酸;

pH稳定性+++

3-12(工作)2-14CIP,短期)

最大流速

600cm/h   XK16H=5cm

推荐流速

150cm/h

+颗粒大小呈正态分布,在该范围内的颗粒占总数的95%以上

++脱去金属离子时稳定性

+++CIP是指脱去金属离子时的pH稳定性。

 

3     预装柱技术参数

产品名称

预装柱体积/ml

内径×柱床mm×mm

耐压

建议流速+ml/min

保存液++

SC- Ni NTA FF

1

7×25

0.3MPa

0.2-2.0

20%乙醇

5

16×25

1.0-10.0

+建议流速是使用过程中的流速,CIP过程及用到有机溶剂时用最低流速或40cm/h线性流速

++20%乙醇需要脱气使用方法。

 

4     使用方法

4.1        将预装柱接入层析系统

Ø  打开包装,取出层析柱。使用前检查层析柱是否完好,以及层析柱在运输过程中是否进气变干,若发生以上情况请联系公司销售;

Ø  启动层析系统,确保排净层析系统内的气泡,并设置层析系统报警压为 0.3MPa,然后调整并保持最低流速运行;

Ø  将预装层析柱接入层析系统。

4.2        层析柱预处理

Ø  5个柱体积蒸馏水冲洗掉柱子里的20%乙醇。

4.3        层析方法

4.3.1    缓冲液:适用于 His 标签纯化过程的缓冲液首选磷酸盐缓冲液,pH 范围在中性(7-8之间),避免适用 EDTA 及柠檬酸盐等,表 1 2 常见添加试剂对蛋白的影响。

4.3.2    平衡缓冲液需要含有低浓度的咪唑,这可以减少宿主蛋白同介质的非特异结合,同样品中也要加入相同浓度的咪唑。

4.3.3    缓冲液中必须加入 0.15~0.5M NaCl 以消除离子交换作用。

1 不影响蛋白质结合到固定化金属离子亲和介质的添加物

添加物

常用浓度

添加物

常用浓度

磷酸盐、Tris、硼酸盐、HEPES

20-100mmol/L

非离子型去污剂


NaCl

2mol/L

Trition X-100

2%

KCl

1mol/L

Tween-20

2%

盐酸胍

6mol/L

辛基葡糖苷

2%

尿素

8mol/L

十二烷基麦芽糖苷

2%

甘油

50%

C12E8,C10E6

2%

异丙醇

60%

2-巯基乙醇

20mmol/L

乙醇

30%

PMSF(蛋白酶抑制剂)

1mmol/L

两性去污剂(CHAPS


胃蛋白酶抑制剂

1umol/L

1%苯甲脒(蛋白酶抑制剂)

1mmol/L

亮抑酶肽(蛋白酶抑制剂)

0.5ug/mL

  表 2 有可能破坏蛋白质结合到固定化金属离子亲和介质的添加物

添加物

常用浓度

添加物

常用浓度

2-巯基乙醇

20mmol/L

组氨酸

可用于替代咪唑

强还原剂(DTTDTE

0.1mmol/L

甘氨酸

-

螯合剂(EDTAEGTA

0.1mmol/L,从介质中夺取Ni2

谷氨酰胺

-

离子去污剂(胆酸盐,SDS

-

精氨酸

-

叠氮化钠

3mmol/L

氯化铵

-

柠檬酸盐

可耐受低浓度



 

4.3.4    流速:针对柱子的高度在 10~15cm 高的情况下可以选用<150cm/h 的流速,柱高增大时需要适当降低流速。

4.3.5    样品及上样量:为防止样品堵塞柱子,在上样前样品需要用 0.45μm 的微孔滤膜过滤,并将样品的 pH 和电导率调整到与平衡缓冲液一致,平衡液咪唑浓度等因素影响 Ni NTA 6FF 的上样量。

4.3.6    洗杂:用平衡缓冲液冲洗至少5个柱体积,直至紫外吸收值降到适当值彻底平衡。

4.3.7    洗脱:

竞争性洗脱:线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质,如 0-0.5M咪唑,0-50mM 组氨酸,0-2M NH4C l。梯度洗脱最好在平衡缓冲液的恒定 pH 下进行。

可降低缓冲液的 pH 进行洗脱,当缓冲液 pH 降低至 4 以下时,金属离子会同介质解离从而达到洗脱目的。(如果目的蛋白对低 pH 敏感,建议洗脱收集液中加入 1/10 体积的 1M Tris-HClpH9.0 进行中和)

螯合剂 EGTA EDTA 可将金属离子同介质解离而达到洗脱目的,洗脱产物中Ni 2+ 可用脱盐柱去除。介质可 用 0.1M NiSO 4 再次饱和后使用。

 

5     柱效检测

5.1        柱效测定可以采用丙酮作为指示剂或者NaCl作为指示剂,按照下表配制指示剂溶液和流动相。


丙酮法测柱效

NaCl法测柱效

样品

1.0%v/v)丙酮水溶液

2M NaCl(溶于水)

样品体积

1.0%柱体积

1.0%柱体积

流动相

0.4M NaCl水溶液

流速

30cm/h

30cm/h

检测器

UV 280 nm

电导率

5.2        计算柱效:

  根据UV或者电导率曲线计算理论塔板高度(HETP)、理论塔板数(N)和非对称因子(As),公式如下:            

      HETP=L/N                           

      N=5.54(VR/Wh) 2                     

 其中:VR=保留体积                  Wh=半高峰宽                       L=柱高                             N=理论塔板数                       

     VRWh的单位应一致;            

     As=b/a

 其中:

     a= 10%峰高处的第一个半峰宽

     b= 10%峰高处的第二个半峰宽

5.3        结果评价

 由以上公式计算出的 HETP 的数值若小于三倍介质平均颗粒大小且非对称因子在0.8~1.8 则判定为合格。

 对于不理想的柱效需要分析原因并重新装柱。

 

6     注意事项

Ø  层析柱为塑料制品,不要使其长时间置于过酸过碱环境中;

Ø  为了避免堵塞层析柱,所有样品和缓冲液需要用 0.45um 膜过滤;

Ø  为了得到良好的分离效果,避免缓冲液与层析柱有太大温差变化;

Ø  层析柱可以放在层析冷柜中使用,但是需要适当降低流速;

Ø  层析柱放置在无阳光直射的地方。

Ø  为了减少 Ni2+的脱落对蛋白的影响,建议是上样前先用纯化水冲洗 5 个柱体积, 然后用洗脱缓冲液冲洗 5 个柱体积,最后用平衡缓冲液平衡层析柱后再上样。

 

7     清洗与再生

7.1        再生:杂质残留和 Ni 2+ 的脱落将会影响柱子的层析性能及载量降低。根据生产需要,在每个 1-5 个循环后需要重新挂镍。

Ø  2-5 个柱体积脱镍缓冲液(50mM PB0.5M NaCl0.1-0.2M EDTA, pH 7.0)脱镍;

Ø  2-3CV 0.5M NaCl 过柱,去除残留的 EDTA

Ø  0.5 倍柱体积 0.2M NiSO 4 过层析柱;

Ø  5 倍柱体积纯化水去除未结合金属离子;

Ø  5 倍洗脱缓冲液清洗层析柱;

Ø  用平衡缓冲液平衡层析柱后待用。

7.2        清洗:杂质残留将会影响柱子的层析性能。如果聚集严重,将会堵塞柱子,反压增大并影响流速。所以定期的原位清洗能够防止污染物在柱床的聚集,有助于保持介质的载量,流速和基本特性。

Ø  首先脱去镍离子;

Ø  除去因离子交换作用吸附的蛋白:用 2-3 倍柱床体积的 2M NaCl 溶液清洗柱子,再 3 倍柱床体积蒸馏水清洗柱子;

Ø  沉淀或变性物质:可以使用 1M NaOH 处理 0.5-1h 来去除。

Ø  疏水结合物质:2 倍柱体积 70%乙醇或 30%异丙醇洗涤柱子,立即用至少5个柱体积的过滤灭菌的平衡缓冲液,反向清洗。

 

8     灭菌

可采用 70%乙醇处理 12h 以上或脱镍后的介质可以采用 1M NaOH 处理 0.5-1h 达到灭菌的目的。

 

9     储存

预装柱储存于20%乙醇中,2-8℃。为了防止乙醇挥发以及微生物生长,使用后的层析柱建议3个月更换一次新鲜的保存液。

 

10   订购信息

货号

产品名称

规格

SCB0E004A

SC-   Ni NTA FF

1ml

SCB0E004B

SC-   Ni NTA FF

5ml

SCB0E004C

Ni   NTA Sinorose 6 Fast Flow

5ml

Ni NTA Sinorose 6 Fast Flow为对应填料


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