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蛋白纯化

Protein G Sinorose 4 Fast Flow

Protein G Sinorose 4 Fast Flow是通过溴化氰活化的方式将 Protein G 固定到基架上而制成的一种亲和介质。Protein G 与 Protein A 相比有着更为宽广的结合谱,同时 Protein G 不仅与抗体的 Fc 片段有着强有力的结合,也和抗体的 Fab 片段有着弱的相互作用,所以Protein G 4FF 常用于分离纯化来自细胞培养物中的抗体或者抗体片段,以及从各种种属的血清中纯化抗体。本产品具有广谱lgG结合、高Fc段结合活性、高抗级吸附量和性能稳定等特点,可重复多次使用。...
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产品介绍

1     产品简介

Protein G是来自G链球菌组的细胞表面蛋白,是Ⅲ Fc-受体型蛋白。Protein G通过非免疫机制结合抗体的Fc区域,并能特异性结合lgGFc区域,对一些多克隆抗体lgGs对人源的lgG抗体能有更强的组合。在标准缓冲液下,Protein G能够结合所有的人源性的亚类抗体和所有鼠源性 lgG亚类抗体,包括鼠的lgG或者兔的lgGalgGb。天然Protein G具有蛋白和细胞表面结合域,重组Protein G去除了白蛋白和细胞表面结合域,以减少非特异结合。

Protein G Sinorose 4 Fast Flow是通过溴化氰活化的方式将 Protein G 固定到基架上而制成的一种亲和介质。Protein G Protein A 相比有着更为宽广的结合谱,同时 Protein G 不仅与抗体的 Fc 片段有着强有力的结合,也和抗体的 Fab 片段有着弱的相互作用,所以Protein G 4FF 常用于分离纯化来自细胞培养物中的抗体或者抗体片段,以及从各种种属的血清中纯化抗体。本产品具有广谱lgG结合、高Fc段结合活性、高抗级吸附量和性能稳定等特点,可重复多次使用。

 

2     介质技术参数

外观

白色浆状物,放置可分层

基架

高度交联的4%琼脂糖

颗粒大小 +

50-160μm

功能基团

Protein   GE.coli

配基密度

~2mg   Protein G/ml介质

交联方式

溴化氰活化

动态结合载量 ++

20mg   IgG/ml介质

化学稳定性

40℃,1周:1M醋酸(pH2.0)、6M盐酸胍、70%乙醇

流速范围

150-250cm/h0.1MPaXK50H=25cm

pH稳定性

3-9(工作)2-10CIP,短期)

+颗粒大小呈正态分布,在该范围内的颗粒占总数的95%以上

++线性流速200cm/h,柱高10cm,缓冲液条件:20mM PB0.15M NaClpH7.4

 

3     预装柱技术参数

产品名称

预装柱体积/ml

内径×柱床mm×mm

耐压

建议流速ml/min

保存液++

SC- Protein G 4FF

1

7×25

0.3MPa

0.2-2.0

20%乙醇

5

16×25

1.0-10.0

+建议流速是使用过程中的流速,CIP过程及用到有机溶剂时用最低流速或40cm/h线性流速

++20%乙醇需要脱气使用方法。

 

4     使用方法

4.1        将预装柱接入层析系统

Ø  打开包装,取出层析柱。使用前检查层析柱是否完好,以及层析柱在运输过程中是否进气变干,若发生以上情况请联系公司销售;

Ø  启动层析系统,确保排净层析系统内的气泡,并设置层析系统报警压为 0.3MPa,然后调整并保持最低流速运行;

Ø  将预装层析柱接入层析系统。

4.2        层析柱预处理

Ø  5个柱体积蒸馏水冲洗掉柱子里的20%乙醇。

4.3        层析方法

4.3.1    缓冲液:Protein G IgG在中性环境中结合,建议使用 20mM PBpH7.0 作为结合缓冲液。其中,Protein A Protein G 和不同属免疫性球蛋白的结合能力对比(表 1)。

      表 1. Protein A Protein G 与不同种类的免疫性球蛋白结合强度对比

种类

亚类

ProteinG   结合强度

Protein   A结合强度

 

 

 

 

IgA

-*

可变的

IgD

-

-

IgE

-

-

IgG1

++++

++++

IgG2

++++

++++

IgG3

++++

-

IgG4

++++

++++

IgM

-

可变的

鸟蛋黄

IgY

-

-


++++

++


++


++

-

几内亚猪

IgG1

++

++++

大颊的鼠类


++


++++

++

树袋鼠


-

骆驼


-

恒河猴


++++

++++

 

 

小鼠

IgG1

++++

IgG2a

++++

++++

IgG2b

+++

+++

IgG3

+++

++

IgM

-

可变的


+++

+++


+++

++++

 

 

大鼠

IgG1

-

IgG2a

++++

-

IgG2b

++

-

IgG3

++

绵羊


++

/-

*加号越多表示结合强度越强,减号表示结合强度极弱甚至不结合

4.3.2    流速:根据柱子的高度一般选用 50~300cm/h 的流速,柱高越大流速越慢。

4.3.3    样品及上样量:为防止样品堵塞柱子,在上样前样品需要用 0.45μm 的微孔滤膜过滤,并将样品的 pH 和电导率调整到与平衡缓冲液一致,流速越低动态结合载量越高。

4.3.4    洗杂:用平衡缓冲液冲洗至少5个柱体积,直至紫外吸收值降到适当值彻底平衡。

4.3.5    洗脱:通过改变缓冲液 pH 进行洗脱,建议使用 0.1M 的甘氨酸 pH2.5- 3.0,作为洗脱缓冲液。为了保持某些酸敏感 IgG 的活性,洗脱收集管中可预加入 1/10柱体积的 1M Tris-HClpH9.0 进行中和。

 

5     柱效检测

5.1        柱效测定可以采用丙酮作为指示剂或者NaCl作为指示剂,按照下表配制指示剂溶液和流动相。


丙酮法测柱效

NaCl法测柱效

样品

1.0%v/v)丙酮水溶液

2M NaCl(溶于水)

样品体积

1.0%柱体积

1.0%柱体积

流动相

0.4M NaCl水溶液

流速

30cm/h

30cm/h

检测器

UV 280 nm

电导率

5.2        计算柱效

根据UV或者电导率曲线计算理论塔板高度(HETP)、理论塔板数(N)和非对称因子(As),公式如下:           

HETP=L/N                              

N=5.54(VR/Wh) 2                       

其中:VR=保留体积                     Wh=半高峰宽                           L=柱高                                N=理论塔板数                          

VRWh的单位应一致;                 

As=b/a

其中:

a= 10%峰高处的第一个半峰宽

b= 10%峰高处的第二个半峰宽

5.3        结果评价

由以上公式计算出的 HETP 的数值若小于三倍介质平均颗粒大小且非对称因子在0.8~1.8 则判定为合格。对于不理想的柱效需要分析原因并重新装柱。

 

6     注意事项

杂质残留将会影响柱子的层析性能。如果聚集严重,将会堵塞柱子,反压增大并影响流速。所以定期的原位清洗能够防止污染物在柱床的聚集,有助于保持介质的载量,流速和基本特性。

Ø  先用 2 个柱体积洗脱液洗涤;

Ø  沉淀或变性物质:可以使用 6M 盐酸胍处理 0.5-1h 来去除;

Ø  疏水结合物质:2 倍柱体积 70%乙醇洗涤柱子,立即用至少 5 倍柱体积的过滤灭菌的平衡缓冲液,反向清洗。


7     清洗与再生

杂质残留将会影响柱子的层析性能。如果聚集严重,将会堵塞柱子,反压增大并影响流速。所以定期的原位清洗能够防止污染物在柱床的聚集,有助于保持介质的载量,流速和基本特性。

Ø  先用 2 个柱体积洗脱液洗涤;

Ø  可用 70%乙醇浸泡 12h 去除,然后用至少 5 倍柱体积的结合液平衡。

Ø  可用非离子型去污剂如 0.1% Trtion X-100 37℃条件下处理,接触时间为 1min

然后迅速用至少 5 倍柱体积的结合液平衡。

 

8     灭菌

可采用 70%乙醇处理12h 以上或可以采用含有0.1M 醋酸的20%乙醇处理 1h 以上达到灭菌的目的。

 

9     储存

预装柱储存于20%乙醇中,2-8℃。为了防止乙醇挥发以及微生物生长,使用后的层析柱议3个月更换一次新鲜的保存。

 

10   订购信息

货号

产品名称

规格

SCB0E003A

SC- Protein G 4FF

1ml

SCB0E003B

SC- Protein G 4FF

5ml

SCB0E003C

Protein G Sinorose 4 Fast Flow

5ml

Protein G Sinorose 4 Fast Flow为对应填料


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